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非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒操作步骤
时间:2019-03-01 点击次数:845

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒操作步骤

  兽用

【兽药名称】

通用名称:非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

汉语拼音:Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名称:African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名称:无

【主要成分与含量】

 

【作用与用途】  用于血液、血球粉、淋巴结、脾脏、扁桃体中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

【用法与判定】

1 用法

1.1 样品处理

血液样品直接用;淋巴结、脾脏、扁桃体样品,用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨,再加10.0 mL PBSpH 7.2,含1万单位青霉素和1万单位链霉素)用MixMax漩涡振荡器混匀(样品不足2.0 g1:5比例加PBS),对处理的待检样品置70℃,30分钟灭活后,3 000 r/min,4 ℃离心5分钟,取上清液,编号备用;血球粉处理同上,只不过省掉研磨步骤。

1.2 样品存放

采集或处理好的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24 h;若需长期保存,须放置-80 ℃冰箱,但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。

1.3 操作步骤

1.3.1 病毒DNA的提。ㄊ褂曼/span>A盒)

1)待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示,取n个灭菌的1.5 mL离心管,逐管编号。

2)每管加入Buffer A 500 mL。

3)每管分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各200 mL,充分混匀,室温放置10分钟。

4)取与上述离心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管,编号。将离心管中的溶液转移至DNase-Free吸附柱,(为避免堵塞吸附柱,尽量不要吸悬浮杂质)。

5)用TH-15高速离心机设置13000 r/min室温离心30秒。

6)弃去收集管液体,将吸附柱放回收集管中。

7)吸附柱内加入600 μL Buffer B,13000 r/min离心30秒。

8)弃去收集管液体,将吸附柱放回收集管中。

9)重复步骤(7),(8)。

1013000 r/min空柱离心2分钟,去除残留液。

11)将每个吸附柱分别移入新的1.5mL离心管中,向柱中央加入50 μL Buffer C,室温静置1分钟,13000 r/min离心30秒,离心管中液体即为模板DNA。获得的DNA溶液,冰上保存备用(注意提取的DNA须在2 h内进行PCR 扩增,若需长期保存须放置-80 ℃冰箱,但应避免反复冻融)。

1.3.2 荧光PCR扩增(使用B盒)

1)从试剂盒中取出荧光PCR反应液、Taq酶,室温融化后,2 000 r/min离心5秒。设所需PCR管数为nn = 样本数+1管阴性对照+1管阳性对照),每个测试反应体系需要20 μL 荧光PCR反应液和0.5 μL Taq酶。计算好各试剂的使用量,加入一适当体积小管中,充分混合均匀后,向每个PCR管中各分装20 μL。

2)分别向上述PCR管中加入1.3.111)中制备的DNA溶液各5μL,盖紧管盖,500 r/min 离心30秒。

3)将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内,作好标记。反应参数设置:

第一阶段,预变性95/3分钟

第二阶段,95/15秒,52/10秒,60/35秒共45个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。

2 判定

2.1 结果分析条件的设定

阈值设定原则:根据仪器噪声情况进行调整,以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。对于多通道荧光PCR仪,选定FAM(465-510)检测通道读取检测结果,ABI仪器选择FAM无荧光淬灭基团。

2.2 质控标准

2.2.1 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

2.2.2 阳性对照的Ct值应小于等于28,并出现典型的扩增曲线。

2.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次实验视为无效。

2.3 结果判定

2.3.1 阴性:无Ct值,且无特征性扩增曲线,表明样品为阴性。

2.3.2 阳性:Ct值≤38.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品为阳性。

2.3.3 Ct值大于38.0,且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的,判为阳性,否则判为阴性。

【注意事项】

1 实验室应至少分三个区:样品处理区、反应混合物配制区和检测区。

2 各区物品均为专用,不得交叉使用,避免污染。检测结束后,应立即对工作台进行清洁。

3 Buffer A有很强的腐蚀性,切勿沾到皮肤或衣服上,否则应立即用大量清水冲洗并擦干。

4 在整个检测过程中应注意避免交叉污染:提取核酸时应用灭菌的镊子夹取离心管;对离心管开盖时应避免粘在手上或溅出,否则要立即更换手套。

5 反应液在使用前要彻底融化,并将反应液与Taq酶瞬时离心将液体甩至管底。分装反应液时,应尽量避免产生气泡。上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。

6 阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡12秒。

7 试剂盒中各组分应避免反复冻融。

8 对样品及其废弃物的操作应严格遵守生物安全规定。

9 本试剂盒仅供兽医及相关专业人士使用。

【贮藏与有效期】  非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的A盒室温保存,B盒在-20℃保存,有效期为12个月。

【规格】  48检测/

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